肺癌是当今世界上对人类健康和生命危害最大的恶性肿瘤之一，其中非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）占所有肺癌病例85%以上^\[[@b1]\]^。表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor, EGFR）是分子量为170 kDa的跨膜受体，在大多数上皮来源的肿瘤中表达增高，包括NSCLC^\[[@b2]\]^。放疗作为NSCLC的重要治疗手段，可直接或间接作用于DNA，其中DNA双链断裂（DNA double strand break, DSB）是最致命的^\[[@b3]\]^，但仍有一部分NSCLC对放疗不敏感。野生型EGFR可在放疗后1 h-4 h内入核，进行DNA损伤的修复而具有放疗保护的作用; 而NSCLC突变型*EGFR*不能入核修复，对放疗相对敏感^\[[@b3]-[@b5]\]^。吉非替尼和厄洛替尼可抑制EGFR胞内端酪氨酸激酶，阻止下游信号传导，达到抑制肿瘤细胞增殖，促进肿瘤细胞凋亡^\[[@b6]\]^。本实验旨在研究吉非替尼对NSCLC细胞株H358是否有放疗增敏作用及其机制。

1. 材料与方法 {#s1}
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1.1. 材料 {#s1-1}
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NCI-H358为人NSCLC细胞株，购自中国科学院细胞库，EGFR野生型，在基因水平上扩增，对吉非替尼敏感。主要试剂包括：吉非替尼（为阿斯利康公司赠予），称重研磨溶于DMSO，终浓度为10 mmol/L，分装后-20 ℃保存备用。EGFR（14C8）：sc-81450（Santa Cruz公司），Anti-phospho-Histone H2A.X（Ser139），clone JBW301（Millipore公司），Lamin B1 polyclonal antibody（Biovision公司），TRITC-II抗（Invitrogen公司），HRP-II抗（Antgene公司），BCA蛋白浓度检测分析试剂盒（Thermo公司），细胞核浆蛋白分离提取试剂盒（Thermo公司），ECL化学发光试剂盒（GE Healthcare公司），Complete, EDTA-free protease inhibitor cocktail tablets（Roche公司）。主要仪器包括：医用直线加速器（瑞典ELEKTA-precise），激光共聚焦显微镜（日本Olympus公司），凝胶成像灰度定量分析系统（美国Bio-Rad公司）。

1.2. 实验分组及照射方法 {#s1-2}
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将H358细胞分为X线组和X线+吉非替尼组，前者进行单纯X线照射，后者为H358细胞在1 μg/mL吉非替尼作用24 h后进行再进行X线照射。H358细胞照射采用同济医院医用直线加速器机架角180度，源皮距100 cm，6 MV X线等中心照射，平皿、细胞培养瓶或24孔板下垫1 cm厚有机玻璃板。

1.3. 细胞培养 {#s1-3}
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细胞培养采用含RPMI-1640培养液，10%胎牛血清，10, 000单位/mL青链霉素的培养基，于37 ℃，5%CO~2~培养箱培养，隔天换液，细胞传代每4-5天一次。

1.4. 克隆形成实验 {#s1-4}
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消化细胞，计数后按不同照射剂量接种合适细胞（0 Gy、2 Gy、4 Gy、6 Gy、8 Gy分别接种的细胞数为200、5, 000、10, 000、20, 000、40, 000）到60 mm直径的平皿，两组细胞每个剂量设3个副孔。培养贴壁后实验组加含吉非替尼浓度为1 μmol/L的培养液，对照组只换液，药物作用24 h后分别进行0 Gy、2 Gy、4 Gy、6 Gy、8 Gy X线照射，重新换培养基继续培养10 d-14 d。形成克隆后，结晶紫染液染色20 min，自来水充分冲洗后晾干，显微镜下计数每一剂量下含细胞数大于50个的细胞克隆数。以0 Gy组计算克隆形成效率（plating efficicy, PE），计算各个剂量下的细胞存活率（survival fraction, SF），PE=（0 Gy剂量下集落数/细胞接种数）^*\**^100%，SF=某一剂量照射组细胞形成的克隆数/（该组细胞种植数×PE），用Excel拟合剂量生存曲线，SPSS 13.0软件利用单靶多击模型计算2 Gy的克隆形成率（surviving fraction of 2 Gy, SF2）、平均致死剂量（mean lethal does, D0）、准阈剂量（quasi-threshould does, Dq）、放射增敏比（sensitive enhancement ratio, SER）值。

1.5. 免疫荧光 {#s1-5}
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胰酶消化对数生长期的细胞，细胞计数板计数，稀释至1×10^5^/ml密度，接种约2, 000/孔细胞至24孔板，使细胞在盖玻片上贴壁生长，以4 Gy X线照射，X线+吉非替尼组以1 μmol/L吉非替尼提前24 h预处理。后于以PBS洗，4%多聚甲醛于放疗后不同时间（γ-H2AX分别于放疗后0 min，10 min，30 min，1 h，3 h，6 h，12 h，24 h）固定，EGFR于放疗后0 min，15 min，30 min，45 min，60 min，3 h）固定细胞15 min，PBS洗3遍，0.2% Triton X-100室温作用15 mim，PBS洗3遍，5%山羊封闭血清室温孵育1 h，加I抗1:100（γ-H2AX, EGFR）、4 ℃过夜，PBS洗3遍，TRITC-II抗1:50、37 ℃避光孵育50 min，PBS洗，1 μg/mL Hoechst33342避光孵育15 min，PBS洗，甘油封片，固定至载玻片上，避光放置，激光共聚焦显微镜观察照相。

1.6. 免疫印记 {#s1-6}
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以4 Gy X线照射两组生长至铺满瓶底80%-90%的细胞，X线+吉非替尼组以1 μmol/L吉非替尼提前24 h预处理，以放疗后不同时间（0 min, 15 min, 45 min, 60 min）胰酶消化，离心收集细胞，提取细胞核蛋白，BCA法测各组核蛋白浓度。制备5%浓缩胶，8%分离胶，以60 μg蛋白上样，电泳，275 mA电流转至PVDF膜140 min，5%脱脂奶粉室温封闭90 min，EGFR及Laminb1以1:1, 000稀释4 ℃孵育过夜，PBS洗，HRP-II抗以1:5, 000稀释室温孵育2 h，PBS洗，ECL室温作用5 min后稍吸干，于暗室胶片曝光。扫描胶片，凝胶成像灰度定量系统对蛋白条带进行灰度分析。

1.7. 统计学分析 {#s1-7}
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各组实验重复3次，数据取均数，实验数据用SPSS 13.0进行统计学处理，*P* \< 0.05为差异有统计学意义。

2. 结果 {#s2}
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2.1. 克隆形成实验拟合剂量生存曲线 {#s2-1}
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[图 1](#Figure1){ref-type="fig"}是用Excel软件拟合的H358细胞剂量生存曲线，以放疗剂量为横坐标，SF值取对数作为纵坐标，结果显示两组数据拟合的曲线分开，X线组各个剂量的SF值均大于X线+吉非替尼组，X线组SF2值为0.011, 1，D0值为4.435，Dq值为5.399，X线+吉非替尼组SF2值为0.000, 865，D0值为2.487，Dq值为2.494，SER值为2.815。

![H358细胞剂量生存曲线\
H358 cells dose-survival curve](zgfazz-14-11-841-1){#Figure1}

2.2. 激光共聚焦显微镜观察放疗后细胞核内γ-H2AX焦点情况 {#s2-2}
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[图 2](#Figure2){ref-type="fig"}为激光共聚焦显微镜照相显示H358细胞经4 Gy X照射线后不同时间点细胞核内γ-H2AX焦点的情况，蓝色底代表H358细胞核，红色光点即为γ-H2AX焦点。X线组放疗后10 min细胞核内开始出现γ-H2AX焦点并随时间增加，在60 min达高峰，随后递减（[图 2A](#Figure2){ref-type="fig"}）; 而X线+吉非替尼组的γ-H2AX焦点数在各时间点均比X线组多，而且一直持续到放疗后12 h细胞核内还有较多γ-H2AX焦点，24 h仍存在（[图 2B](#Figure2){ref-type="fig"}）。

![激光共聚焦显微镜观察H358细胞4 Gy放疗后不同时间点细胞核内γ-H2AX焦点的情况。A：X线组; B：X线+吉非替尼组。\
Immunostaining for confocal microscopy testing for nuclear γ-H2AX foci of H358 cells after 4 Gy X ray. A: X ray group; B: X ray+Gefitinib group.](zgfazz-14-11-841-2){#Figure2}

2.3. 激光共聚焦显微镜观察放疗后EGFR入核情况 {#s2-3}
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激光共聚焦显微镜观察照相显示H358细胞4 Gy放疗后不同时间点细胞核内EGFR表达情况，蓝色代表H358细胞核，红色光点为EGFR，X线组0 min时EGFR焦点位于胞浆或核周，在放疗后进入细胞核内，45 min达高峰，后逐渐减少（[图 3A](#Figure3){ref-type="fig"}）; 而在X线+吉非替尼组，EGFR焦点分布在核外胞浆中，没有单纯放疗组的入核趋势（[图 3B](#Figure3){ref-type="fig"}）。

![激光共聚焦显微镜观察H358细胞4 Gy放疗后不同时间点细胞核内EGFR焦点的情况。A：X线组B：X线+吉非替尼组。\
Immunostaining for confocal microscopy testing for nuclear EGFR foci of H358 cells after 4 Gy X ray. A: X ray group; B: X ray+Gefitinib group.](zgfazz-14-11-841-3){#Figure3}

2.4. Western blot检测细胞核内EGFR表达及蛋白条带灰度定量分析 {#s2-4}
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[图 4](#Figure4){ref-type="fig"}为Western blot检测H358细胞放疗后1 h内各时间点核蛋白EGFR的表达，X线组在放疗后15 min细胞核内即有EGFR表达，且条带随时间而加深（[图 4A](#Figure4){ref-type="fig"}）; 而X线+吉非替尼组无EGFR核蛋白条带（[图 4B](#Figure4){ref-type="fig"}）。根据蛋白条带采用凝胶成像灰度定量系统计算各条带的灰度值，并绘制成柱状图（[图 4C](#Figure4){ref-type="fig"}），X线组的灰度值均高于X线+吉非替尼组（*P*=0.042）。说明H358细胞在放疗后1 h内，在各个相同的时间点，X线+吉非替尼组细胞核EGFR表达少于X线组，可能是吉非替尼通过某种途径阻止EGFR放疗后进核。

![Western blot检测H358细胞4 Gy放疗后不同时间点细胞核内EGFR的表达情况。A：X线组; B：X线+吉非替尼组; C：EGFR带灰度定量柱状图。\
Western blot testing for nuclear EGFR of H358 cells after 4 Gy X ray. A: X ray group; B: X ray+Gefitinib group; C: The densitometric analysis of EGFR expression.](zgfazz-14-11-841-4){#Figure4}

3. 讨论 {#s3}
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ErbB家族由EGFR（erbB1）、erbB2（Neu）、erbB3和erbB4四个成员组成，属于跨膜糖蛋白。配体结合导致胞内EGFR的二聚体化，进而激活受体及下游的各种信号转导通路，如Ras/Raf/MEK/ERK、PKC、STATs和PI3K/Akt途径^\[[@b7],\ [@b8]\]^。在肿瘤细胞，EGFR激活引起的信号通路主要调节肿瘤细胞增殖、分化、细胞存活、细胞周期进展及血管生成^\[[@b9]\]^。肿瘤细胞EGFR及下游信号通路的激活有以下途径：①配体与EGFR过表达的肿瘤细胞结合; ②配体非依赖的途径：*EGFR*突变或EGFR下游信号分子突变，如RAS或PTEN^\[[@b10],\ [@b11]\]^。另外，放疗也可导致EGFR及其下游信号通路的激活。这些途径的激活在肿瘤治疗引起的化疗及放疗耐受中起着重要作用^\[[@b12],\ [@b13]\]^。

放疗是NSCLC治疗的重要组成部分，真核生物中，放疗所致的DSB修复有两种方式：同源重组（homologous recobination, HR）和非同源断端连接（non-homologous ends jion, NHEJ），其中NHEJ在放疗导致的DSB修复中占主导地位^\[[@b14]\]^。NHEJ由DNA依赖性蛋白酶（DNA-PK）、XRCC4、DNA连接酶IV及ATM催化，与Mre11、Rad50和Nbs1（MRN）形成复合物从而使DSB断端再连接而修复^\[[@b15]\]^。但是除了SCLC与NSCLC之间敏感性的差异，同一组织类型的敏感性差异也存在。研究^\[[@b16]\]^显示，EGFR是决定放疗敏感性的重要因素之一，野生型EGFR可以在放疗后入核，与DNA-PKcs结合，从而对DSB进行修复，因而对放疗抵抗; 而突变型EGFR则不能入核与DNA-PKcs结合，所以对放疗相对敏感。基于EGFR在肿瘤放疗修复中的作用，分子靶向药物小分子酪氨酸激酶受体抑制剂（tyrosine kinase recepter inhibitor, TKI）及作用于EGFR的单克隆抗体被单药或与化/放疗联合用于临床。西妥昔单抗（C225）与放疗联合用于头颈部肿瘤，患者的总生存率明显比单纯放疗组高。这可能基于西妥协单抗对肿瘤细胞的放疗增敏作用，这已在临床前的研究^\[[@b17],\ [@b18]\]^中证实。研究^\[[@b17]\]^显示，C225是通过抑制放疗引起的EGFR入核，废除EGFR-DNA-PKcs的相互作用，从而延迟DNA损伤修复，起到头颈部肿瘤放疗增敏的作用。吉非替尼是小分子受体抑制剂，它通过与EGFR酪氨酸激酶结合而起作用，本实验旨在探讨吉非替尼是否与C225相似有对NSCLC有放疗增敏的作用以及可能机制。

本课题选取H358细胞株，它是EGFR野生型人NSCLC细胞株，EGFR在基因水平上扩增，对吉非替尼敏感。选择1 μg/mL吉非替尼作为增敏浓度，是根据吉非替尼的每日处方剂量后测患者的血药浓度及H358的IC~20~而定^\[[@b16]\]^。吉非替尼的半衰期为24 h。

克隆形成实验证明吉非替尼可提高人NSCLC细胞株H358的放疗敏感性。从20世纪60年代，人们开始用离体细胞存活曲线来评价细胞放射的效应，因其可以反应细胞增殖性死亡，故仍最适于反应细胞照射后存活情况。本实验根据H358细胞放疗后克隆形成情况，计算SF值绘制剂量生存曲线，可以看到X线+吉非替尼组各个剂量的细胞存活率均低于X线组，SF2值也同样如此。且X线+吉非替尼组的D0、Dq也低于X线组，SER为2.185。说明前者放疗后发生增殖性死亡的细胞多于后者，大部分细胞因丧失了继续增殖生长的能力而不能形成克隆，即吉非替尼使H358细胞的放疗敏感性增加。

实验还显示，吉非替尼增加放疗引起的H358细胞核内γ-H2AX的表达，并延长其存在时间。在真核细胞中，外源性化学、物理及生物性物质所致的DSB都可能会触发H2AX的快速磷酸化，从而形成γ-H2AX。可用免疫荧光技术，清楚地观测到以γ-H2AX焦点形成为特征的DNA双链断裂的区域，这种染色质的改变通常被认为是细胞对DSB做出的敏感反应。γ-H2AX的形成在DNA的DSB中不仅起到损伤的标志性作用，而且在DNA的DSB修复中具有连接的作用^\[[@b19]\]^。实验中，X线+吉非替尼组放疗后细胞核内γ-H2AX焦点在各个时间点均多于X线组，焦点持续的时间也更长，说明吉非替尼增加了放疗引起的DSB形成，使H358细胞DNA损伤增加，并使DNA修复延迟。结合之前实验结果，吉非替尼通过影响放射后H358细胞的损伤及修复而提高放疗的的敏感性。

另外，通过免疫荧光激光共聚焦显微镜观察显示放疗后H358细胞核内EGFR的变化，结果是X线组EGFR在放疗后1 h内进入细胞核，而X线+吉非替尼组各组EGFR光点位于细胞浆及核周。与共聚焦结果相符，Western blot实验证明，X线组H358细胞放疗后1 h内EGFR表达随时间增加，而X线+吉非替尼组细胞核内没有EGFR表达，两组结果有统计学意义（*P* \< 0.05）。由于EGFR可通过放疗激活进行下游信号通路的传导，其中野生型EGFR可直接在放疗后入核，与DNA-PKcs结合进行DSB修复起到放疗保护的作用，结合实验结果，我们可以推测，吉非替尼是通过抑制EGFR放疗后入核进行DSB修复，而增加H358细胞放疗敏感性。

肿瘤细胞的EGFR在放疗后迅速入核，*EGFR*基因敲除的细胞因DNA修复被抑制而显示出明显的放疗增敏作用^\[[@b20]\]^，这说明在细胞受到放射线后EGFR在肿瘤细胞的存活中起着重要作用，核内EGFR与DNA损伤的修复有着必然的联系。本实验的结果显示，EGFR是影响H358细胞放疗敏感性的重要因素，尤其是野生型EGFR高表达NSCLC，而吉非替尼能够通过与EGFR结合，使EGFR不能进入核内进行放疗后损伤的修复，从而使放疗敏感性增加。也有研究^\[[@b21]\]^显示，吉非替尼可通过抑制ATM的活性从而制止放疗引起的DNA损伤修复及诱使有丝分裂停止使细胞死亡而起到放疗增敏的作用。

然而，吉非替尼是否还通过其它途径影响H358细胞放疗敏感性; 入核后是否通过影响EGFR-DNA-PKcs复合物的形成而起作用，抑制DNA-PKcs的活性是否会对核内EGFR的表达及放疗敏感性产生影响，后续的研究正在进行; 体内实验与体外实验是否能得出相同的结论; 能否将EGFR作为放疗增敏的靶点应用于临床，以上问题还需要进一步的体外及体内实验来验证。
